MIKROBIOLÓGIA 1

 

 

Téma: Príprava laboratórneho skla, sterilizácia, dezinfekcia

 

Laboratórne sklo určené na kultiváciu, resp. sterilnú manipuláciu s mikroorganizmami (MO), musí byť uzavreté pred samotnou sterilizáciu zátkou. Vatová zátka slúži ako filter zabraňujúci prenikaniu MO z okolia, ale zároveň nebráni prísunu vzduchu potrebného pri kultivácii MO. Zátka je pri sterilizácii opatrená v niektorých prípadoch aj alobalom, ktorý sa odstraňuje až po naočkovaní média. Pri kultivácii je možné použiť aj kovové zátky, kde prienik vzduchu zabezpečuje medzera medzi sklom a zátkou. MO do nádoby neprenikajú vďaka gravitácii.

 

Sterilizácia – vyhubenie všetkých živých foriem MO z pracovných povrchov, z médií, roztokov a pod., vyhubí vegetatívne aj rezistentné formy (termorezistentné, chemorezistentné)

 

Spôsoby sterilizácie:

fyzikálne –               suché teplo (plameň, horúco vzdušný sterilizátor)

vlhké teplo (autokláv – pary)

pasterizácia (UHT)

frakcionovaná sterilizácia, tyndalizácia

filtrácia

žiarenie (UV, X, β, γ)

chemické –             dvojstupňová sterilizácia:

1.        vlastná expozícia v sterilizačnom prostriedku (formaldehyd, ethylénoxid, persteril)

2.        odvetrávanie z dôvodu zníženia koncentrácie rezíduí sterilizačného média na povrchu sterilizovaného predmetu, resp. oplachovanie sterilnou destilovanou vodou

 

Dezinfekcia – vyhubenie vegetatívnych foriem MO z pracovných povrchov, predmetov a povrchu tela

 

Dezinfekčné prostriedky:        prípravky s obsahom halogénov (chlór, jód)

oxidačné činidlá (H₂O₂)

alkoholy

soli ťažkých kovov

aldehydy

alkalické činidlá (hydroxidy, uhličitany)

deriváty fenolu

organické amóniové soli

 

 

Pozn.

Kapitola 1 v skriptách Cvičenia z mikrobiológie, autori: Obernauerová, Gbelská, PRIF UK 1999

Pozrieť: sterilizovanie v autokláve a horúco-vzdušnom sterilizátore (podmienky)

MIKROBIOLÓGIA 2

 

 

Téma: Príprava kultivačných médií

 

Kultivačné médiá

 

Všeobecné požiadavky

               Voda

               Živiny - zdroj energie (svetlo – fotoautotrofné MO, anorganické látky – litoautotrofné MO, organické látky

– heterotrofné)

zdroj uhlíka (CO₂, sacharidy, bielkoviny, lipidy)

zdroj dusíka (N₂, NH₃, NO₃, bielkoviny, peptidy, aminokyseliny...)

biogénne prvky (stopové prvky, vo forme anorganických solí – kovové a nekovové prvky, ktoré sú

súčasťou enzýmov a iných bielkovín, esenciálne vo veľmi nízkych koncentráciách)

rastové faktory (vitamíny, aminokyseliny, puríny, pyrimidíny, čistá forma alebo ako súčasť bunko-vých extraktov)

pH (kvasinky, mikromycéty, baktérie)

Konzistencia

Osmotický tlak

 

Rozdelenia živných médií podľa:

Pôvodu                 - prirodzené

- umelé – syntetické, presne definované zloženie

- semisyntetické – obohatené o extrakty alebo peptóny

 

konzistencie            - tekuté

- tuhé (agar, želatína, kremičité gély)

·         šikmé agary – v skúmavkách

·         platne – na Petriho miskách

použitia                   - univerzálne (MPA – pre baktérie, sladina – pre kvasinky a mikromycéty)

- selektívne (podporia rast jednej širšej skupiny MO – napr. rast G+ baktérie)

- diagnostické (podporia rast užšej skupiny MO, napr. zo všetkých G- rastú na Endovom agare len

tzv. coli – aerogenes baktérie)                           

- diagnosticko – selektívne (podporia rast len určitého rodu MO, napr. Wilson-Blairova pôda pre salmonely, alebo laktózová pôda s trypaflavínom pre enterobaktérie)

 

Uchovávanie živných médií

4-6°C – niekoľko týždňov (rozkladanie živín, vysušovanie média)

laboratórna teplota (20 - 22°C) – niekoľko dní

- uzavreté, označené názvom a dátumom

 

Príprava živných médií

- komerčné dehydrované pôdy – zarábajú sa do vody, premiešajú,

               - návažky jednotlivých zložiek kultivačného média, doplniť vodou, premiešať

1. pridá sa do nich agar podľa odporúčania výrobcu, rozpustia sa zohriatím, napipetujú sa do 1/3 objemu skúmavky, potom sa autoklávujú uzavreté zátkou, nechajú sa stuhnúť v šikmej polohe – šikmé agary

2. pridá sa do nich agar podľa odporúčania výrobcu, autoklávujú sa a sterilne sa nalievajú do sterilných Petriho misiek, nechajú sa stuhnúť vo vodorovnej polohe –  platne

3. bez prídavku agaru sa zarobia rovno do Erlenmeyerovej banky, autoklávujú sa, nechajú sa vychladnúť na laboratórnu teplotu – tekuté média

 

ÚLOHY

 

1. Príprava šikmých agarov – 1ks/študent

MPA (2% komerčná pôda, 2% agar, voda) – 50ml

CzDA (5,5% komerčná pôda, 2% agar, voda) – 50ml

YPD (1% glukóza, 0,5% peptón, 0,5% kvasničný autolyzát, 2% agar, voda) – 50ml

Ø       navážky a voda do označených baniek (3 banky – 100ml)

Ø       pôda sa rozvarí, rozpipetuje do ¼ objemu vopred označenej skúmavky, skúmavky sa uzatvoria zátkou, autoklávujú sa a nakoniec sa nechajú stuhnúť v šikmej polohe, tak aby plocha pôdy nepresiahla 2/3 dĺžky skúmavky

 

1. Príprava agarových platní

CzDA – 50ml – 2PM

YPD – 6×200ml – 6×8PM

Ø       navážky a voda do označených baniek (1 banka – 100ml pre CzDA, 6 baniek 500ml pre YPD)

Ø       pôda sa autoklávuje a sterilne sa nalieva do sterilných vopred označených misiek cca 20 – 25 ml/Petriho miska, nechá sa stuhnúť vo vodorovnej polohe

 

1. Príprava tekutého kultivačného média

PV – 10ml/Erlenka, 1% peptón, 0,5% NaCl – pre skupinu (1 banka – 50ml)

 

1. Príprava sterilnej vody

- 80ml/Erlenmayerova banka – pre dvojicu (4 banky – 100ml)

 

Pozn.

Kapitola 2 v skriptách Cvičenia z mikrobiológie, autori: Obernauerová, Gbelská, PRIF UK 1999

Pozrieť rozdiel: peptón – extrakt

MIKROBIOLÓGIA 3

 

 

Téma: Očkovacie techniky

 

Očkovanie – prenesenie časti populácie MO z prostredia, kde rástli (prirodzené, umelé) alebo sa udržiavali (pod glycerolom -20°C alebo -80°C) do čerstvého vysterilizovaného živného média (tekuté, tuhé).

 

Nástroje na očkovanie           

bakteriologické očko na baktérie alebo kvasinky, ihla na mikromycéty (kov)

Ø       pred aj po použití opáliť vo zvislej polohe v plameni

Ø       pred naberaním kultúry vždy ochladiť z vnútornej strany o sklo misky alebo skúmavky, ponorením do agaru alebo ponorením do kondenzovanej vody na vrchnáku misky

Ø       kultúru naniesť na tuhé médium (vlnovka, čiarovanie očkom, vpich ihlou) alebo do tekutého média, rozotrieť v kvapke média na stene nádoby, alebo uvoľniť rýchlym pohybom priamo do média

               pipety (sklenené alebo automatické)

Ø       presné množstvo suspenzie na tuhé médium alebo do tekutého média

Ø       pri očkovaní na tuhé médium rozotrieť sklenenou hokejkou (pred rozotieraním namočiť do alkoholu a prejsť cez plameň, nechať dohorieť, ochladiť na agare mimo kultúry a až potom rozotierať)

vysterilizované špáradlá

Ø       na tuhé média (čiarky)

Ø       do tekutého média v skúmavke, rozotrieť v kvapke média alebo nechať celé špáradlo ponorené do média

 

Čistá kultúra – populácia MO získaná pomnožením jedinej izolovanej bunky – samostatná kolónia

 

Techniky získavania čistej kultúry

Ø       izolácia rozterom – čiarovanie očkom

Ø       izolácia zrieďovaním a následným rozterom hokejkou po nanesení na tuhé médium (desiatkové riedenie vo vode, vo fyziologickom roztoku alebo v tekutom médiu)

Ø       Kochova zrieďovacia metóda (desiatkové riedenie v roztopenej agarovej pôde, obsah skúmaviek sa priamo vylieva do sterilných Petriho misiek a nechá stuhnúť)

Ø       izolácia zalievaním (inokulum sa napipetuje do čistej Petriho misky a zaleje sa roztopeným agarom, krúživým pohybom misky sa inokulum premieša s médiom)

Ø       mechanická izolácia mikromanipulátorom

Ø       izolácia pomocou inhibičných vplyvov (selektívne média)

 

Kultivácia MO

optimálna teplota

Ø       baktérie

Ø       kvasinky

Ø       mikromycéty

kyslíkový režim

Ø       aeróbna – prevzdušňovanie cez vatovú zátku alebo kovový vrchnák na nádobách s tekutým médiom, cez póry medzi vrchnákom a dnom Petriho misky, prísun kyslíka sa zvýši pretrepávaním alebo prísunom sterilného vzduchu (fermentory)

Ø       anaeróbna – kultivačné nádoby sú tesne uzatvorené          

§         prídavok látok, ktoré znížia oxidačno-redukčný potenciál média (cysteín, tioglykolát sodný, kys. askorbová)

§         anaerostaty (CO₂)

§         súčasná kultivácia dvoch MO, z ktorých jeden svojim metabolizmom spotrebuje všetok kyslík nad povrchom média, čím umožní anaeróbnemu druhu rásť

spôsob kultivácie

§         staticky – pevné média, v niektorých prípadoch aj pre tekuté média

§         submerzná     – jednorázová – plynule sa mení morfológia buniek, zloženie média, rastová

krivka (fázy: lag, log, stacionárna, odumieranie)

– kontinuálna – bunky sú udržiavané v tzv. log fáze (chemostat, turbidostat),

konštantný počet buniek, zloženie média sa nemení, prívod čerstvého média, odvádzanie rovnakého objemu média s metabolitmi

 

ÚLOHY

 

1. Očkovanie šikmých agarov

MPA- baktérie: Escherichia coli, Bacillus cereus (vlnovka očkom)

YPD- kvasinky: Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe (vlnovka očkom)

CzDA- mikromycéty: Penicillium sp., Aspergillus sp. (vpich ihlou alebo vlnovka očkom)

- každý študent zaočkuje na jeden šikmý agar

 

MIKROBIOLÓGIA 4, 5 a 6

 

 

Téma: Mikroskopia natívnych a fixovaných farbených preparátov MO

 

Mikroskopia – používa sa na priame vyšetrenie vzoriek, napr. potravín, odberového materiálu na prítomnosť MO, po použití rôznych špecifických farbiacich techník aj na ich bližšiu identifikáciu.

 

Mikroskopia živých MO – zistenie prítomnosti a pozorovanie MO v ich prirodzenej forme (živé aj mŕtve)

-            natívny preparát

-            vitálne farbenie

·         farbenie glykogénu a bielkovín

·         farbenie tukových zásob

·         farbenie volutínu

·         vitálny test (zistenie fyziologického stavu buniek)

-            negatívne farbenie (tuš, nigrozín, kongočerveň + HCl)

 

Natívny preparát – skutočný neporušený tvar MO, organely a granulácia cytoplazmy, pohyb MO (pasívny – nepravidelný Brownov pohyb spôsobený prúdením kvapaliny, aktívny – vyznačujúci sa určitou pravidelnosťou, ktorý sa zastaví po pridaní smrtiaceho roztoku 1% HgCl₂); pripravuje sa rozotrením suspenzie do kvapky vody, fyziologického roztoku alebo do zriedeného alkoholu (nezmáčavý povrch mikromycét)

Vitálny test – zistenie životaschopnosti MO v suspenzii, prídavok metylénovej modrej umožní rozlíšiť mŕtve (modré) bunky od živých (biele); živé bunky, ktoré majú funkčný enzymatický aparát prostredníctvom enzýmov (reduktáz)  premieňajú modrú farbičku na jej bezfarebnú leukoformu.

Farbenie tuku – Sudan III je farbivo, ktoré umožní pozorovať tukové kvapôčky vnútri buniek niektorých druhov kvasiniek, ktoré sú schopné nahromadzovať tuk, napr. Rhodotorula glutinis, ktorá má vnútornú zásobu tukov až 43% (bežne obsahujú kvasinky približne 2-3% tuku).

Negatívne farbenie – zafarbí sa pozadie preparátu (čierne – farbenie podľa Burriho, modré – farbenie kongočerveňou), bunky ostávajú nezafarbené; pozoruje sa tvar a veľkosť buniek, prípadne vonkajšie povrchové štruktúry - puzdrá

 

Mikroskopia fixovaných MO – pozorovanie usmrtených MO, umožňuje kontrastnejšie pozorovanie MO a ich organel, povrchových štruktúr a pod.

 

Sušenie – preparát pripravený v kvapke vody sušíme nad plameňom kahana

 

Fixácia – preparát fixujeme v plameni 3-krát ho prenesieme cez plameň, bunky pritom priľnú ku sklíčku, usmrtia sa, čím sa zlepší príjem farbiva a rôznych činidiel (moridlá, odfarbovacie činidlá), a na druhej strane sa zníži riziko práce s patogénnymi MO (iné spôsoby fixácie: v organických zlúčeninách alebo v parách formaldehydu, či kyseliny osmičelej)

 

Farbenie

farbičky používané pri príprave preparátu sú v podstate molekuly zložené:

-            chromofórovej časti (nositeľ farbiaceho efektu)

-            auxochrómovej časti (nefarbí, ale umožňuje lepšiu väzbu farbiva k bunkám)

podľa auxochrómovej časti sa farbivá delia na:

-            kyslé - skladajú sa z kyseliny a jej soli, nositeľom farbiaceho efektu je anión, farbia hlavne cytoplazmu a v nej prítomné štruktúry (eozín, erytrozín, kyslý fuksín, trypanová modrá, bavlníková modrá, kyselina pikrová, nigrozín)

-            zásadité - skladajú sa zo zásady a jej soli, nositeľom farbiaceho efektu je katión, farbia hlavne jadro, bazofilne časti buniek a celé baktérie (zásaditý fuksín, safranín, genciánová violeť, kryštáľová violeť, mlachitová zelená, metylénová modrá)

-            neutrálne – zmes solí kyselín a zásad (azúr II-eozín)

zosilnenie účinku farbiva:       predĺženie dĺžky pôsobenia farbiva

zvýšením teploty

moridlá – látky, reagujúce s objektom aj s farbivom (anilín, fenol, laktofenol, Lugolov roztok)

spôsoby farbenia:   progresívne (farbenie do dostatočného zafarbenia objektu)

regresívne (preparát sa úmyselne prefarbí a potom sa odfarbuje – kontrastnejšie zafarbenie štruktúr buniek, pričom každá štruktúra bunky sa odfarbuje s inou intenzitou – farbenie diferencovaním)

metódy:

-            orientačné farbenie – použitie jednej farbičky

·         Ziehlov karbolfuksín koncentrovaný - červené

·         genciánová violeť – Ehrlichov roztok - fialové

·         metylénová modrá podľa Loefflera - modré

-            diagnostické farbenie – farbenie zmesou farbiacich roztokov, spojené s odfarbovaním, pričom rôzne štruktúry buniek sa nefarbia rovnako, čo umožňuje lepšie rozlíšenie organel

·         farbenie podľa Gramma

·         farbenie acidorezistentných MO

·         farbenie spór

·         farbenie puzdier

 

Orientačné farbenie – farbenie za použitia jedného druhu farbiva, umožňuje zistiť prítomnosť MO vo vzorke, tvar buniek; všetky farbivá používané na orientačné farbenie obsahujú aj moridlo; farba buniek závisí od druhu použitého farbiva

Farbenie podľa Gramma – základné diagnostické farbenie používané na rozlíšenie baktérií na G+ a G–; G+ baktérie obsahujú vo svojej bunkovej stene polysacharid (peptidoglykan) a teichoové kyseliny (sacharidy), nachádza sa tu minimálne množstvo lipidov a proteínov, na rozdiel od nich G– baktérie obsahujú vo svojej bunkovej stene len veľmi tenkú vrstvu peptidoglykanu, ale množstvo lipidov a proteínov (makromolekuly lipopolysacharidov a lipoproteínov), preto je ich bunková stena dobre priepustná pre organické rozpúšťadlá (acetón, alkohol); po primárnom zafarbení a morení kryštálovou violeťou a Lugolovým roztokom sa farbia G+ aj G– rovnako (farbivo tvorí s Lugolovým roztokom veľké farebné komplexy), ale po odfarbení v alkohole sa z G– odplaví farbivo, lebo alkohol je schopný prenikať cez lipidovú vrstvu v ich bunkách, zatiaľ čo G+ nie sú schopné pre hrubú vrstvu peptidogykanu farbivo vyplavovať; na kontrastnejšie odlíšenie sa použije druhé farbivo (safranín, karbolfuksín); G+ baktérie ostávajú fialové až tmavo-modré od kryštáľovej violeti a Lugolovho roztoku, G– baktérie sú červené od safranínu alebo karbolfuksínu

Farbenie acidorezistentných MO (Ziehl-Neelsen) – acidorezistentné MO len veľmi ťažko prijímajú farbivá (koncetrovaný karbolfuksín), ale po zafarbení si ho uchovávajú aj pri premývaní alkoholom a kyselinami; patria sem mykobaktérie, niektoré aktinomycéty (ale aj spóry baktérií a kvasiniek), farbia sa vo všeobecnosti koncentrovanými farbivami, pri zvýšenej teplote a predĺženom čase farbenia, v prípade potreby aj opakovane; s acidorezistenciou súvisí prítomnosť acidorezistentných mykolových kyselín v bunkových stenách spomínaných MO; neacidirezistentné MO, ktoré sa farbia spolu s acidorezistentnými sa pri premývaní kyselinami spätne odfarbia a dofarbujú sa pre kontrastnejšie zachytenie iným farbivom (metylénová modrá alebo malachitová zeleň; acidorezistentné bunky sa farbia na červeno, neacidorezistentné sa farbia podľa použitého difernciačného farbiva na modro alebo zeleno

Farbenie spór (Wirtz a Couhlin) – spóry podobne ako acidorezistentné MO, len veľmi ťažko prijímajú do svojho vnútra farbivo (5% malachitová zeleň), ale po prijatí ho v sebe udržia ja napriek premývaniu; spóry sa tvoria v nepriaznivých podmienkach vo vnútri vegetatívnych buniek, ak prestane pôsobiť stimul, ktorý navodil ich tvorbu, vyklíčia ako nové vegetatívne bunky; po farbení koncentrovaným farbivom, zahriatí a predĺženom čase pôsobenia sa farbia spóry aj cytoplazma vegetatívnych buniek, po premývaní, resp. oplachovaní vodou, sa cytoplazma odfarbí a je možné dofarbiť ju iným farbivom (zriedený karbolfuksín); spóry sa farbia na zeleno, vegetatívne bunky na ružovo

Farbenie puzdier – puzdro je polysacharidový obal niektorých druhov baktérií, ktorý zvyšuje ich virulenciu (znemožní fagocytózu), tvorí sa v podmienkach nízkej koncentrácie dusíka a v prítomnosti vyššej koncentrácie sacharidov v médiu; farbí sa dvoma spôsobmi:

-          farbí sa krátko ako klasický fixovaný preparát za kysla koncentrovaným karbolfuksínom, po opláchnutí sa cytoplazma buniek dofarbí 20% CuSO₄; puzdro sa farbí na ružovo, cytoplazma buniek je sýto fialová

-          farbí sa ako negatívny preparát v kvapke tušu 1% metylénovou modrou; puzdro sa nezafarbí a je pozorovateľné ako biela obruba okolo cytoplazmy na tmavom pozadí, bunky sa farbia na modro

 

Určovanie MO

 

Baktérie – prokaryota

Bunky      koky        jednotlivé

                              v dvojiciach (diplokoky)

                              v retiazkach (streptokoky)

                              v štvoriciach (tetrakoky)

                              v balíčkoch po osem kokov (sarcíny)

                              v strapcoch (stafylokoky)

           paličky    jednotlivé

                              v dvojiciach

                              v retiazkach

               vibriá – rožkovito zahnuté tyčinky

               spirily a spirochéty – špirálovito stočené baktérie

 

Kolónie    tvar (bodkovité, okrúhle, trojcípe, vláknité, nepravidelné, ...)

               okraj (hladký, pílkovitý, zúbkovitý, laločnatý, vlnitý, rozstrapkaný, ...)

               prierez (plochý, plochovypuklý, vypuklý, preliačený, ...)

vzhľad (priehľadná, priesvitná, hladká, drsná, granulovaná, radiálne pruhovaná, ...)

konzistencia (mäkká, kožovitá, suchá, vlhká, ...)

               veľkosť (priemer v dvoch na seba kolmých rovinách)

 

Spóry (umiestnenie v bunke)  terminálne, centrálne, subterminálne

 

Bičíky – tvorené flagelínom, pohybový aparát bunky (prítomnosť a umiestnenie) 

atrichálne bunky

           monotrichálne

               lofotrichálne

               amfitrichálne

peritrichálne

 

Brvy – tvorené pilínom

 

Huby (mikromycéty, kvasinky)

Nižšie      jednobunkové (jednojadrové, mnohojadrové – cénocytické)

Vyššie     mnohobunkové (bunky sú oddelné membránami, ale komunikácia medzi nimi je zabezpečená pórmi)

                              mycélium (substrátové – vegetatívne, vzdušné – generatívne)

               jednobunkové (jednotlivé bunky – tzv. kvasinkovitá forma)

                              mycélium alebo pseudomycélium (bunky si zachovávajú samostatnosť, nie jú prepojené pórmi)

Rozmnožovacie spóry a útvary húb      

nepohlavné rozmnožovanie

−            rozrastanie mycélia

−            úlomky vegetatívneho mycélia (rozpad mycélia na hýfy)

−            artrospóry (jednotlivé vegetatívne bunky ulomené z koncov hýf)

−            chlamydospóry (hrubostenné bunky vznikajú v čase nepriaznivých rastových podmienok)

−            sklerócium (hrubostenný myceliárny útvar vzniká v čase nepriaznivých rastových podmienok)

−            špecifikované nepohlavné spóry (exo- alebo endospóry; mikro- makrokonídie) – na nosičoch

pohlavné spóry – vznikajú splynutím gamét alebo gametangií (špecifikované hýfy + a –)

−            oospóry

−            zygospóry

−            askospóry

−            bazídiospóry

 

 

 

 

 

 

 

 

ÚLOHY

 

Predtým, než začnete:

-          odoberať radšej menej kultúry, resp. suspenzie, aby nebol preparát príliš hustý

-          fixácia (v plameni, preparát držíme pinzetou) nie je sušenie (nad plameňom, preparát držíme rukami)

-          skontrolovať koncentráciu farbív podľa potreby jednotlivého farbenia (1% alebo 0,01% metylénová modrá, koncentrovaný alebo zriedený karbolfuksín)

-          preparáty oplachujeme v šikmej polohe pod tečúcou vodou cez prsty, voda nesmie stekať na sklíčko priamo z vodovodu

-          ak oplachujeme jeden preparát niekoľkokrát v šikmej polohe (napr. pri Grammovom farbení, pri farbení acidorezistentných MO) oplachujeme vždy v tom istom smere (označiť si smer stekania vody, alkoholu, atď.) zabráni sa tým vzniku artefaktov

-          nie každý preparát sa prikrýva krycím sklíčkom

 

1.  Natívny preparát

-            dvojica pripraví jeden natívny preparát z kvasiniek (do kvapky vody) a jeden natívny preparát z mikromycét (do kvapky alkoholu) na podložnom sklíčku

-            prikryť krycím sklíčkom, nadbytok tekutiny odsať buničitou vatou

-            na výber               kvasinky: S. cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Trigonopsis variabilis

mikromycéty: Penicillium sp., Aspergillus sp.

 

2.        Negatívne zobrazenie

-            dvojica pripraví jeden preparát Azotobacter sp. (Asbyho agar – kolónie v okolí zrniek zeminy) do kvapky tušu, nigrozínu alebo kongočervene

-            suspenziu sa rozotrieť pomocou druhého podložného sklíčka po celom povrchu a nechať zaschnúť nad plameňom, v prípade kongočervene po zaschnutí prevrstviť na niekoľko sekúnd  1% HCl, vysušiť priložením buničitej vaty (nezotierať!!!)

-            pozorovať pod olejovou imerziou

 

3.  Vitálny test

-            dvojica pripraví preparát z kvapky tekutej suspenzie zo starého sušeného droždia, nechá zaschnúť nad plameňom

-            prevrstviť kvapkou 0,01% metylénovej modrej

-            prikryť krycím sklíčkom, vyhodnotiť % živých buniek

 

4. Farbenie tuku

-         dvojica pripraví natívny preparát Rhodotorulla sp. do kvapky roztoku Sudan III

-         po 10-20 minútach prikryť krycím sklíčkom a pozorujeme pod mikroskopom

 

5.  Monochromatické farbenie

-            dvojica pripraví preparát S. cerevisiae alebo Endomyces magnusii do kvapky vody, rozotrie druhým podložným sklíčkom po celej ploche, nechá zaschnúť nad plameňom kahana a fixuje ho v plameni

-            prevrstviť sa na 5 min vybraným farbivom (Ziehlov karbolfuksín koncentrovaný, genciánová violeť – Ehrlichov roztok, kryštálová violeť, metylénová modrá podľa Loefflera)

-            suspenziu zahriať 3× do výstupu pár (nie do varu!!!)

-            opláchnuť tečúcou vodou, vysušiť priložením buničitej vaty (nezotierať!!!)

-            pozorovať pod olejovou imerziou

 

6.  Farbenie podľa Gramma

-            dvojica pripraví dva preparáty do kvapky vody z dvoch učiteľom určených MO, rozotrie druhým podložným sklíčkom po celej ploche, nechá zaschnúť nad plameňom kahana a fixuje ho v plameni (Escherichia coli, Proteus sp., Serratia marcescens, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus)

-            na 60 sekúnd prevrstviť roztokom kryštálovej violeti, opláchnuť tečúcou vodou

-            na 20 sekúnd prevrstviť Lugolovým roztokom, neoplachovať vodou ale 20-30 sekúnd premývať etanolom

-            30-60 sekúnd dofarbovať zriedeným karbolfuksínom alebo safranínom, opláchnuť tečúcou vodou, vysušiť priložením buničitej vaty (nezotierať!!!)

-            pozorovať pod olejovou imerziou

 

 

7.  Farbenie acidorezistentných MO

-            v 1ml koncentrovaného karbolfuksínu povariť 5 min zmiešanú suspenziu acido- a neacidorezistentných MO

-            dvojica pripraví na podložné sklíčko preparát z povarenej suspenzie Mycobacterium smegmatis a Bacillus cereus, rozotrie druhým podložným sklíčkom po celej ploche, nechá zaschnúť nad plameňom kahana a fixuje ho v plameni

-            preparát odfarbiť v šikmej polohe kyslým alkoholom, opláchnuť tečúcou vodou

-            10-30 sekúnd sa dofarbiť malachitovou zeleňou alebo roztokom metylénovej modrej, opláchnuť tečúcou vodou, vysušiť priložením buničitej vaty (nezotierať!!!)

-            pozorovať pod olejovou imerziou

 

8.  Farbenie spór

-            v 1ml 5% malachitovej zelene povariť 5 min hustú suspenziu vysporulovaných buniek

-            dvojica pripraví preparát z povarenej suspenzie Bacillus cereus alebo Saccharomyces cerevisiae, rozotrie druhým podložným sklíčkom po celej ploche, nechá zaschnúť nad plameňom kahana a fixuje ho v plameni

-            opláchnuť tečúcou vodou

-            dofarbiť 2-3 min zriedeným karbolfuksínom, opláchnuť tečúcou vodou, vysušiť priložením buničitej vaty (nezotierať!!!)

-            pozorovať pod olejovou imerziou

 

9A.  Farbenie puzdier podľa Burriho

-            dvojica pripraví preparát Klebsiella sp. alebo Azotobacter sp. do kvapky tušu, rozotrie druhým podložným sklíčkom po celej ploche, nechá zaschnúť nad plameňom kahana a fixuje ho v plameni

-            1 minútu farbiť 1% roztokom metylénovej modrej, opláchnuť tečúcou vodou, vysušiť priložením buničitej vaty (nezotierať!!!)

-            pozorovať pod olejovou imerziou

 

9B.  Farbenie puzdier za kysla koncetrovaným karbolfuksínom

−            dvojica pripraví preparát Klebsiella sp. alebo Azotobacter sp. do kvapky vody, rozotrie druhým podložným sklíčkom po celej ploche, nechá zaschnúť nad plameňom a fixuje ho v plameni

−            farbiť maximálne 20 sekúnd za kysla koncentrovaným karbolfuksínom

-            opláchnuť 20% CuSO₄, vysušiť priložením buničitej vaty (nezotierať!!!)

-            pozorovať pod olejovou imerziou

 

 

 

Pozn.

Kapitoly 4, 5 a 6 v skriptách Cvičenia z mikrobiológie, autori: Obernauerová, Gbelská, PRIF UK 1999

Pozrieť rozdiel fruktifikačných štruktúr u rodov Penicillium a Aspergillus (vedieť nakresliť, popísať jednotlivé štruktúry konídionosičov)

MIKROBIOLÓGIA 7

 

 

Téma: Mikroskopické meracie metódy

 

 - meranie a počítanie objektov pod mikroskopom

 

Meranie 

dĺžka, šírka – pomocou okulárového (O.m., dieliky bez jednotky dĺžky) a objektívového mikrometra (S.m., dieliky v mikrometroch), kalibrovať pre každé zväčšenie – určiť tzv. mikrometrický koeficient – prepočet na mikrometre → počet dielikov S.m./počet dielikov O.m. × 10µm

hrúbka – pomocou mikrometrickej skrutky zaostrením na dolný a horný povrch objektu a odčítaním posunu na skrutke

 

Metódy stanovenia počtu MO

Priame   

– počítanie MO v Bürkerovej komôrke, určí sa počet živých aj mŕtvych buniek v suspenzii, po zafarbení 0,01% metylénovou modrou sa rozlíšia živé bunky (biele) od mŕtvych buniek (modré); vhodné pre eukaryotické MO – kvasinky, spóry mikromycét

– počítane vyrastených kolónií na tuhom médiu, určí sa počet iba živých buniek (eukaryota, prokaryota) schopných množiť sa a utvoriť kolóniu (tzv. cfu – colony forming unit)

– špeciálne počítače

Nepriame

– stanovenie sušiny

– stanovenie zákalu - turbidimetria

– volurimetria – stanovenie objemu biomasy pomocou centrifugácie

– stanovenie koncentrácie bunkových zložiek (prvky, zlúčeniny), metabolitov (CO₂), ATP

 

Počítanie buniek v Bürkerovej komôrke – slúži na prepočet koncentrácie buniek v médiu (bb/ml)

B.k. – krycie a podložné sklíčko medzi ktorými je medzera 0,1mm, stred podložného sklíčka tvoria dve polia, v každom poli je vyrytá mriežka, rozdelená troma paralelnými čiarami na 9 štvorcov (3×3) s rozmermi 1mm×1mm; štvorec je rozdelený dvoma paralelnými čiarami na 16 menších štvorcov (4×4) s plochou 1/25 mm² (pomyslený kváder nad touto plochou má objem 1/250 mm³, 1/250 000 cm³ ≡ ml ), v miestach, kde sa dvojité čiary pretínajú vznikajú obdĺžniky s plochou 1/100 mm² a štvorčeky s plochou 1/400 mm²

Prepočet koncentrácie bb/ml                 veľký štvorček                         priemerný počet buniek×250 000 bb/ml×Z

                                                              obdĺžnik                                  priemerný počet buniek×1 000 000 bb/ml×Z

                                                              malý štvorček                          priemerný počet buniek×4 000 000 bb/ml×Z

 

Turbidimetrické stanovenie počtu buniek

- svetlo prechádzajúce suspenziou sa pohlcuje bunkami

- pri určitej vlnovej dĺžke (650nm) ide o lineárnu závislosť od koncentrácie buniek

- možnosť zostrojenia kalibračnej krivky

ÚLOHY

 

1. Meranie veľkosti buniek MO

- jedna dvojica okalibruje O.m. pre celú skupinu

- každá dvojica pripraví natívny preparát Saccharomyces cerevisiae alebo Endoromyces magnusii

- zmerať šírku a dĺžku 5 buniek, vypočítať priemernú veľkosť buniek v μm (dך)

 

1. Počítanie buniek v Bürkerovej komôrke a turbidimetria

- pre celú skupinu je pripravená sada štyroch riedení + neznáma vzorka

- stále traja spočítajú pomocou Bürkerovej komôrky počet buniek v jednom riedení (oznámiť počty buniek ostatným študentom v skupine!!!), určí sa priemerná koncentrácia buniek (bb/ml) z každého riedenia, ktorá sa vynesie na os x kalibračnej krivky

- na os y sa nanášajú hodnoty absorbancie (optickej denzity) pri 650 nm

- zmeria sa absorbancia neznámej vzorky – z kalibračnej krivky sa určí počet buniek

 

Pozn.

Kapitoly 4 a 7 v skriptách Cvičenia z mikrobiológie, autori: Obernauerová, Gbelská, PRIF UK 1999

Pozrieť ako sa vypočíta celkové zväčšenie svetelného mikroskopu

 

 

do 2mm – rezistencia

2-5mm – citlivosť na jedno +

5-10mm – citlivosť na + +

12-16 – citlivosť na + + +

ÚLOHY

 

1. Inhibícia rastu MO UV žiarením

-          každá dvojica má pripravených 5ks Petriho misiek s YPD, označiť: na všetkých miskách názov MO a iniciály dvojice, navyše na príslušnej miske označiť K-kontrola, 30, 60, 90, 120

-          na každú misku vyseje 0,1 ml suspenzie Saccharomyces cerevisiae (koncentrácia buniek cca 10⁷ bb/ml) a nechá úplne vsiaknuť do média

-          ožaruje sa v intervaloch 30, 60, 90, 120 sekúnd, ihneď sa odloží do skrinky spolu s neožiarenou kontrolnou miskou, aby sa zabránilo prístupu viditeľného svetla

-          vyhodnotenie: krivka             – na os x sa vynáša doba ožiarenia

– na os y sa vynáša počet prežívajúcich buniek v percentách (odhad,

  pričom neožiarená miska – 100%)

 

1. Inhibícia rastu MO antibiotikami

-          každá dvojica má pripravené 2ks Petriho misiek s MPA, označiť: na každej miske názov MO, iniciály dvojice, skratky vybraných ATB

-          na jednu vyseje 0,1 ml suspenzie Bacillus sp. (G+), na druhú 0,1 ml suspenzie Klebsiella sp. (G–) a nechá úplne vsiaknuť do média

-          na spodnú stranu misky označí skratku vybraného ATB (zapísať výber 4 ATB), tie isté ATB sa použijú na otestovanie citlivosti oboch druhov baktérií

-          sterilnou pinzetou poukladá 4 rôzne antibiotické disky na označené miesta na oboch miskách, jemne položiť celou plochou disku, ale nevtláčať do média

-          pinzetu opáliť zakaždým, aj keď ukladáme disk s tým istým ATB, aby sa predišlo prenosu MO z misky na misku

-          pinzetu vždy ochladiť – teplo môže inaktivovať ATB, prípadne by mohlo dôjsť k horeniu papierového disku

-          vyhodnotenie: zmerať veľkosť inhibičnej zóny a určiť R resp. S, porovnať výsledky medzi oboma druhmi baktérií vzhľadom na to, že jedna z nich G+ a druhá G–

 

Pozn.

Kapitola 8 v skriptách Cvičenia z mikrobiológie, autori: Obernauerová, Gbelská, PRIF UK 1999

Pozrieť aké faktory ovplyvňujú veľkosť inhibičných zón

MIKROBIOLÓGIA 10

 

 

Téma: Mikrobiologické vyšetrenie potravín

 

Mikroflóra potravín

–         primárna – prirodzená nachádzajúca sa v prvotných surovinách určených na výrobu určitej potraviny alebo je pridávaná za účelom navodenia určitého fermentačného procesu (šľachtená) – väčšinou sa odstráni niektorým procesom zakončujúcim výrobu potraviny (pečenie chleba – usmrtenie kvasiniek, pasterizácia mlieka – usmrtenie mliečnych baktérií)

–         sekundárna – kontaminujúca (prítomnosť závisí od kontaminácie surovín použitých vo výrobe, výrobného procesu, mikrobiologickej nezávadnosti obalov, úrovne hygieny, teploty, uskladnenia, obsahu vody,...)

·         MO, ktoré znehodnocujú potraviny (normami určená povolená koncentrácia)

·         patogény, potenciálne patogény, toxíny (nesmú byť prítomné vôbec)

 

Odber vzorky

–         sterilne do sterilných nádob

–         z rôznych hĺbok potraviny (tuhé potraviny), z rôznych fliaš (tekutiny)

–         označenie: druh potraviny, dátum, čas, výrobca, senzorické vlastnosti, stav obalu,...

–         spracovanie do 2 – 4 hod od odberu, v prípade suchých potravín do 24 hod

 

Spracovanie vzorky

–         sterilne s použitím sterilného náradia a nádob

–         vzorky sa upravia to tekutej fázy v riedení 1:10 (1ml tekutiny alebo 1g tuhej potraviny do 9ml sterilnej vody), homogenizovať podľa potreby, nechať usadnúť, na analýzu použiť tekutú fázu vzorky

–         v prípade potreby robiť desiatkové riedenie

–         vysievať paralelne dve Petriho misky    – 0,1 – 0,5ml vzorky – rozter

– 1ml vzorky sa zaleje tekutým agarom ochladeným na 45°C

–         pre baktérie MPA, pre kvasinky SA, pre mikromycéty CzDA, príp. sladinový agar

–         po vsiaknutí vzorky, resp. po stuhnutí média, kultivovať pri požadovanej teplote hore dnom, baktérie 24 – 48 hod, kvasinky a mikromycéty – 3 – 5 dní

–         vyhodnocujú sa tie misky, na ktorých rastú samostatné počítateľné kolónie, počet sa preráta na 1ml alebo 1g pôvodnej vzorky, jednotlivé kolónie sa použijú na presnú identifikáciu MO (pomocou enzymatických a biochemických reakcií, resp. výsevom na selektívne a diagnosticko – selektívne média)

 

 

ÚLOHY

 

Mikrobiologické vyšetrenie potravín

-          každá dvojica má pripravené tuhé médiá v Petriho miskách:

SA+5%NaCl          1ks

SA                          4ks

MPA                       3ks

-     označiť všetky misky iniciálami dvojice, vzorkou (pr. mlieko, chlieb,...)

zrno (jačmeň, kukurica, iné) → poukladať 5 zŕn na pôdu SA + 5% NaCl

chlieb alebo pečivo → poukladať omrvinky na pôdu SA

mlieko – 0,2ml → MPA

jogurt – 0,1ml homogenátu → MPA

syr Niva – 0,1ml homogenátu → SA

majonézový šalát – 0,1ml homogenátu → SA, MPA

kofola – 0,1ml → SA

-          pracovať s automatickými pipetami (sterilné špičky)

-          pracovať sterilne pri kahane, žiadnu vzorku nechytať rukami!!!

-          zrno, chlieb, pečivo poukladať a nadrobiť pomocou opálenej a ochladenej pinzety, misky pred kultiváciou neotáčať

-          3 dvojice pripravia pre celú skupinu homogenáty jogurtu, Nivy, šalátu po 1g do 10ml sterilnej destilovanej vody (okrem váženia pracovať sterilne pri kahane), premiešať, nechať usadiť, vzorku odoberať nad usadenou časťou, misky pred kultiváciou otočiť až po úplnom vsiaknutí vzorky do pôdy

mlieko a kofolu pipetovať priamo, misky pred kultiváciou otočiť až po úplnom vsiaknutí vzorky do pôdy